蛋白糖基化是一種非常重要的蛋白質(zhì)后修飾方式。糖基化對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物功能都可以產(chǎn)生重大影響，生物藥分子的糖基化可能決定了其臨床效果，因此糖基化在生物藥生產(chǎn)中是一個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性，必須在開發(fā)和生產(chǎn)過程中密切監(jiān)視，并在工藝中特異性分離或者去除糖基化分子。近些年來，硼酸親和技術(shù)在糖蛋白純化領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展，其獨(dú)特的親和性引起了研究人員的極大關(guān)注。由于硼酸基于與順式二醇基團(tuán)可發(fā)生可控的可逆共價(jià)鍵合反應(yīng)，后者在糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)中廣泛存在，因而硼酸親和技術(shù)常被用做是一種選擇性富集分離順式二醇化合物的有效提純手段。硼酸親和作用的工作原理如下圖。

APB親和填料是由Astrea Bioseparations公司推出的配基為氨基苯基硼酸鹽的親和層析填料（Aminophenylboronate，簡稱APB），特別適用于糖蛋白的純化，或從非糖基化分子中去除糖蛋白和碳水化合物雜質(zhì)，從而應(yīng)對糖蛋白純化工藝中的各種挑戰(zhàn)，此外，APB填料還可用于純化和去除某些酶，例如硼酸基團(tuán)對活性位點(diǎn)具有親和性的蛋白酶和水解酶等。

APB親和填料有兩種不同的基架可選擇，其中Aminophenylboronate P6XL采用的是Astrea專有的Purabead® P6XL近單分散瓊脂糖微球來生產(chǎn)高度穩(wěn)定的交聯(lián)瓊脂糖基架。 Purabead®產(chǎn)品具有非常均勻的粒徑，可在低背壓條件下實(shí)現(xiàn)可重現(xiàn)的層析柱裝填和高流速。因此，Aminophenylboronate P6XL 是生物工藝應(yīng)用的首選親和填料。Aminophenylboronate A6XL是Astrea的原創(chuàng)產(chǎn)品，該填料的瓊脂糖基質(zhì)具有更寬的粒度分布，更適合小規(guī)?；蛟\斷應(yīng)用。兩種基架都是經(jīng)過優(yōu)化的，有相同的穩(wěn)定的配基和偶聯(lián)物，都適用于各種生物制品的分離和純化。

APB親合填料產(chǎn)品特點(diǎn)

適用于親和純化或去除糖蛋白及聚糖

高純度m-氨基苯硼酸鹽配基

配基通過順式二醇選擇性結(jié)合至碳水化合物基團(tuán)。

高動(dòng)態(tài)結(jié)合載量

填料穩(wěn)定性好，使用壽命長

可耐受0.5 M NaOH清潔，允許數(shù)百次循環(huán)使用

符合ISO 9001標(biāo)準(zhǔn)，批次穩(wěn)定性重復(fù)性好

提供全面的法規(guī)支持文件（RSF），支持GMP生產(chǎn)和商業(yè)化申報(bào)

已有多個(gè)受監(jiān)管的生物制藥生產(chǎn)和醫(yī)療診斷領(lǐng)域用戶使用。

pH穩(wěn)定性:

APB親和填料在pH 3-13（連續(xù)暴露）范圍內(nèi)穩(wěn)定，并且可承受pH 14.0的間歇暴露。

在室溫條件下，在從pH 0.0(1 M HCl) 到pH 14.0 (1M NaOH) 的一系列測試溶液中孵育的APB A6XL的pH穩(wěn)定性曲線。收集上清液樣品并以連續(xù)暴露1周至1年的特定時(shí)間間隔測定配基的脫落情況。

流速
APB P6XL的均勻粒徑使該吸附填料能夠在高線性流速下使用?？梢允褂酶哌_(dá)500 cm/h的操作流速，盡管在層析柱上樣和洗脫期間的流速通常在50–200 cm/h范圍內(nèi)。

APB P6XL（直徑3.2 cm x床高15 cm）的壓力-流速曲線。

結(jié)合載量
APB P6XL/A6XL對糖蛋白的結(jié)合載量范圍為10–20 μmol/g，對碳水化合物的結(jié)合載量高達(dá)30 μmol/g。

操作條件
糖蛋白與APB親和填料的結(jié)合在低至中等離子強(qiáng)度（10–300 mM）和弱堿性pH條件（pH 范圍8.0–9.5）下最佳。可以使用磷酸鹽制備的緩沖液，推薦使用硼酸鹽和甘氨酸進(jìn)行柱平衡。建議結(jié)合流速在50–150 cm/h之間。吸附填料的結(jié)合載量取決于樣品的性質(zhì)，對于糖蛋白來說，通常在10–20 μmol/g的范圍內(nèi)。

通過使用低pH緩沖液或通過使用競爭性二醇，可以從APB親和填料中洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)?？梢允褂胮H4.0的0.1 M甘氨酸/HCl或0.1 M醋酸鹽緩沖液降低pH值進(jìn)行洗脫。對于酸不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)，可以使用合適的競爭性二醇，例如20–200 mM山梨醇，在中性pH緩沖液中進(jìn)行洗脫。

APB親和填料參數(shù)

應(yīng)用案例

1. 用APB P6XL純化胎球蛋白

胎球蛋白是胎牛血清中的主要59 kDa糖蛋白，含有三個(gè)N-鏈和O-鏈碳水化合物側(cè)鏈。該案例介紹了使用APB P6XL層析柱從商品化粗溶液中純化胎球蛋白。

層析色譜圖

胎球蛋白層析條件參數(shù)：

層析柱高度：4 cm

柱體積：3.1 mL

線性流速：50 cm/h

平衡&漂洗緩沖液：50 mM磷酸鈉，pH 9.0

洗脫：山梨醇梯度(0–200mM)

消毒：1M NaOH

2. 重組糖蛋白的捕獲

APB層析填料特別適用于糖蛋白的捕獲和純化。下圖展示了一個(gè)經(jīng)典的親和純化色譜圖，其中有一個(gè)大的流穿和一個(gè)小的離散洗脫峰。在50 mM山梨醇洗脫后達(dá)到完全的目標(biāo)糖蛋白回收。

層析色譜圖

層析條件參數(shù)：

層析柱：直徑1.0 cmx柱床高7.4 cm

平衡漂洗/緩沖液：50 mM甘氨酸/NaOH pH 9.0

洗脫：50 mM 磷酸鹽緩沖液，0-200 mM山梨醇梯度

消毒：0.5 M氫氧化鈉

流速：200 cm/h

APB A6XL純化的糖蛋白Western blot結(jié)果圖（泳道1 分子量marker，泳道2 上樣到APB A6XL的樣品，泳道3 流穿液，泳道4-8 梯度洗脫液）

訂購信息

Aminophenylboronate P6XL

Aminophenylboronate A6XL